油茶CamelliaoleiferaAbel，又稱(chēng)茶油樹(shù)、白花茶、中果油茶、茶子樹(shù)等，屬山茶科Theaceae山茶屬CamelliaL植物是我國特有的木本食用油料樹(shù)種，有2300多年的栽培和利用歷史，與油橄欖、油棕、椰子并稱(chēng)為世界四大木本油料植物，與烏桕、油桐和核桃并稱(chēng)為我國四大木本油料植物。目前，我國油茶面積約有300萬(wàn)hm2，油茶籽年產(chǎn)量100萬(wàn)t左右，年產(chǎn)茶油約26萬(wàn)t，產(chǎn)值約110億元。

　　油茶全身都是寶，葉可凈化空氣，綠化環(huán)境；花可觀(guān)賞，作蜜源；根可保持水土，涵養水源；根皮還可入藥；莖質(zhì)地細密，韌性較好，可用于制作木器、農具等；種子榨取的油—茶油是一種優(yōu)質(zhì)食用油，不飽和脂肪酸含量高達90%以上，以油酸為主，還富含亞油酸和亞麻酸、維生素E、生育酚、角鯊烯等營(yíng)養成分，被譽(yù)為“東方橄欖油”，聯(lián)合國糧農組織重點(diǎn)推薦為健康型高級食用植物油；茶油還能通過(guò)油脂的深加工生產(chǎn)高級保健食用油和高級天然護膚化妝品等；油茶粕可提取茶皂素、制刨光粉和復合飼料；茶殼可提糠醛、鞣料和制活性炭等，發(fā)展油茶生產(chǎn)對提高我國國民經(jīng)濟和人民生活水平具有重大意義。

　　油茶粕是油茶提油后的剩余物，近年我國年產(chǎn)油茶粕70多t，但大多數被廢棄掉或廉價(jià)出口到東南亞等國，有效資源未得到充分利用。我國鐘海雁教授、鄧桂蘭教授等已做過(guò)相關(guān)研究證實(shí)，油茶粕通過(guò)菌種發(fā)酵，可使部分糖類(lèi)、纖維素等主要成分轉化成蛋白質(zhì)。本研究通過(guò)優(yōu)化培養基和高效發(fā)酵菌株的篩選，以達到提高油茶粕蛋白質(zhì)的目的。

　1材料與方法

　　1.1試驗菌種

　　米曲霉、黑曲霉、葡萄汁酵母1445、熱帶假絲酵母1779、地衣芽孢桿菌10181、枯草芽孢桿菌（均購于湖南省微生物研究所）。

　　1.2試驗原料

　　油茶粕（購于湖南農業(yè)大學(xué)油脂與蛋白質(zhì)實(shí)驗室），將油茶粕置于70℃電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱中烘干至水分不再發(fā)生變化。

　　1.3試驗方法

　　1.3.1熱水脫皂

　　油茶粕粉碎、過(guò)篩→加3倍清水→煮沸2h（不斷攪拌，以防止焦灼）→過(guò)濾，濾渣在清水中浸泡24h，反復洗滌，除去上層溶液→過(guò)濾，烘干備用。

　　1.3.2培養基優(yōu)化

　　米曲霉是一類(lèi)產(chǎn)復合酶的菌株，可分解油茶餅粕中的粗蛋白質(zhì)、纖維素、糖類(lèi)物質(zhì)等，故試驗用米曲霉初步篩選發(fā)酵培養基。以油茶粕為主，麥麩為輔，設計了4種培養基配方，見(jiàn)表1。以米曲霉發(fā)酵，在溫度28℃下培養3d。發(fā)酵完后測定培養基中蛋白質(zhì)的含量。

　　1.3.3配伍菌種篩選

　　將白地霉、黑曲霉、米曲霉、地衣芽孢桿菌10181、熱帶假絲酵母1779及葡萄汁酵母斜面分別用無(wú)菌水洗下，30℃搖床振蕩培養48h，分別接入到飼用油茶餅粕發(fā)酵培養基中，28℃下培養72h，觀(guān)察固體平板上各菌株的生長(cháng)情況，同時(shí)，測定培養基發(fā)酵前后蛋白質(zhì)含量的變化。

　　根據各試驗菌的發(fā)酵結果，選用黑曲霉為指示菌。將黑曲霉接種于優(yōu)化的培養基中，28℃下培養48h后，再分別點(diǎn)種其他待選菌，28℃下培養72h，觀(guān)察各菌株的生長(cháng)情況。

　　1.3.4菌種比例及組合優(yōu)化

　　根據平板點(diǎn)種刺激圈試驗，選擇與指示菌配伍的菌種兩株，組成A組菌和B組菌。

　?。?）A組菌兩菌株接種比的確定。將斜面菌種用無(wú)菌水洗下，以接種比為5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5，接種量為10%，分別接入到三角瓶發(fā)酵飼用油茶餅粕發(fā)酵培養基中，28℃生化培養箱培養72h后，105℃烘干至恒重，測定其粗蛋白含量。

　?。?）B組菌兩菌株接種比的確定方法同A組菌。

　?。?）4個(gè)菌種的混合比。將斜面菌種用無(wú)菌水洗下，以A組菌與B組菌的接種比分別為5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5，接種量為10%，分別接入到三角瓶發(fā)酵飼用油茶餅粕發(fā)酵培養基中，28℃生化培養箱培養72h后，105℃烘干至恒重，測定其粗蛋白含量。

　　1.4測定方法

　　蛋白質(zhì)含量測定：凱氏定氮法（GB/T5009.5-2003）；

　　粗脂肪的測定：索氏抽提法；

　　粗纖維含量測定：重量法；

　　可溶性總糖測定：蒽酮法；

　　皂素的測定采用：比色法。

2結果與分析

　　2.1油茶粕化學(xué)成分分析

　　油茶粕的主要成分包括蛋白質(zhì)、茶皂素、粗纖維、可溶性糖等。將油茶粕和熱水脫皂的油茶粕進(jìn)行成分測定，測定結果見(jiàn)表2。

　　從表2可以看出，兩組處理蛋白質(zhì)含量均為9%以上，是一種很好的飼料原料。熱水脫皂后的油茶粕，水溶性物質(zhì)茶皂素和可溶性糖均有所降低，分別為3.81%和2.88%，脫皂率高達79%。

　　2.2培養基優(yōu)化

　　優(yōu)良的培養基可以為微生物的生長(cháng)提供所需的全部營(yíng)養素，包括C源和N源。米曲霉是一類(lèi)產(chǎn)復合酶的菌株，可使油茶粕中的粗蛋白質(zhì)、纖維素、糖類(lèi)物質(zhì)分解中微生物生長(cháng)所需的C源和N源，故試驗用米曲霉來(lái)初步篩選發(fā)酵培養基。將米曲霉接種于4種培養基配方中，發(fā)酵前后蛋白質(zhì)含量見(jiàn)圖1。

　　由圖1可知，各油茶粕培養基發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量均有一定的提高，提高率可達28.00%。其中，以熱水脫皂后的油茶粕制備的培養基中蛋白質(zhì)含量均高于相對應的以未處理的油茶粕制備的，說(shuō)明油茶粕的茶皂素可以抑制微生物生長(cháng)；4組培養基配方中，培養基配方Ⅱ的蛋白質(zhì)提高率較培養基配方Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ的大，說(shuō)明培養基配方Ⅱ的營(yíng)養成分組成較合理，利于微生物的生長(cháng)。由此可見(jiàn)，最佳的培養基配方為：熱水脫皂的油茶粕16g、葡萄糖2g、麥麩1g、（NH4）2SO41g、水19g。

　　2.3配伍菌種篩選

　　混合菌種發(fā)酵效果優(yōu)于單個(gè)菌種發(fā)酵，因混合菌種發(fā)酵可多個(gè)菌種之間互相補償缺陷，進(jìn)行協(xié)同發(fā)酵。點(diǎn)種各菌株處黑曲霉的生長(cháng)情況見(jiàn)表3。

　　地衣芽孢桿菌10181、葡萄汁酵母1445與米曲霉可明顯刺激黑曲霉生長(cháng)，因此確定這3種菌為配伍菌種。

　　2.4菌種比例及組合優(yōu)化

　　2.4.1雙菌種接種比的確定

　　根據配伍菌種的篩選結果，結合黑曲霉和米曲為同一屬的特性，確定地衣芽孢桿菌與黑曲霉為A組，葡萄汁酵母和米曲霉為B組，發(fā)酵確定雙菌種的接種混合比。

　　由圖2和圖3可知菌組A和菌組B在接種比分別為1∶1和1∶1時(shí)粗蛋白含量最高，因此接種比為1∶1時(shí)為雙菌種的最佳接種比。

　　2.4.2菌組接種比的確定

　　將菌組A和菌組B按比例接種，發(fā)酵，結果見(jiàn)圖4。

　　由圖4可知，在菌組A和菌組B的接種比為1∶1時(shí)，粗蛋白含量最高?？傻?，油茶粕生產(chǎn)蛋白飼料輔料的最佳接種混合比為地衣芽孢桿菌10181∶黑曲霉∶葡萄汁酵母1445∶米曲霉=1∶1∶1∶1。發(fā)酵生成的粗蛋白含量為16.94%，較未發(fā)酵時(shí)的10.82%提高了56.56%。

　3結果與討論

　?。?）油茶粕是榨油后的主要副產(chǎn)物，由殘油、茶皂素、可溶性糖、蛋白質(zhì)等有效成分組成，將其高效利用，可以大幅度提高油茶的綜合價(jià)值。將未經(jīng)處理的油茶粕和熱水脫皂后的油茶粕進(jìn)行各組成成分測定，兩組處理蛋白質(zhì)含量均為9%以上，并含可溶性糖、纖維素等可被微生物利用的物質(zhì)，是一種很好的飼料原料。熱水脫皂后的油茶粕，脫皂率高達79%，是一種有效的茶皂素提取方式。因此，油茶粕利用微生物法生產(chǎn)蛋白飼料技術(shù)與熱水提取高純度、高活性茶皂素技術(shù)有機結合以提高油茶粕的利用率可作為下一步研究重點(diǎn)。

　?。?）優(yōu)良的培養基可為微生物的生長(cháng)提供所需的C源、N源等營(yíng)養素。以米曲霉初步篩選油茶粕發(fā)酵培養基，得出最佳配方為：熱水脫皂的油茶粕16g、葡萄糖2g、麥麩1g、（NH4）2SO41g、水19g。其中，熱水脫皂的油茶粕發(fā)酵效果優(yōu)于較未處理的油茶粕的，因油茶粕的茶皂素抑制了微生物生長(cháng)，在油茶粕利用微生物法生產(chǎn)蛋白飼料前必須進(jìn)行脫皂素處理。

　?。?）油茶粕通過(guò)多菌種的協(xié)同發(fā)酵，油茶粕中的多糖、纖維素等物質(zhì)高效轉化成蛋白質(zhì)。通過(guò)平板點(diǎn)種試驗，確定與黑曲霉配伍的菌種為：地衣芽孢桿菌10181、葡萄汁酵母1445與米曲霉；根據三角瓶發(fā)酵培養，獲得了油茶粕發(fā)酵產(chǎn)高蛋白的最優(yōu)菌種組合及發(fā)酵比例為地衣芽孢桿菌10181∶黑曲霉∶葡萄汁酵母1445∶米曲霉=1∶1∶1∶1。發(fā)酵生成的粗蛋白含量為16.94%，較未發(fā)酵時(shí)的10.82%提高了56.56%，從而達到了提高產(chǎn)品的粗蛋白含量的目的。